co na oparzenia gorącą wodą

Mutację 4003delTC ponownie wykazano na obu allelach COL17A1, ale nie zidentyfikowano drugiej zmiany genetycznej. Biorąc pod uwagę te ustalenia, uznano również, że ekson 52 może być całkowicie usunięty lub pominięty w probandzie, ponieważ utrata 390 nukleotydów w tym eksonie przywróci normalną ramkę odczytu w COL17A1. Jednak dodatkowe badania genomowego DNA (konkretnie, obejmujące egzony 51-53), jak również całkowitego RNA z hodowanych keratynocytów tego pacjenta, nie wykazały delecji egzonu 52 z genu COL17A1 lub zmienionego składania pre-mRNA, który prowadził do pominięcia tego egzonu (dane nie pokazane). Niepowodzenie tych badań w wyjaśnieniu ogniskowej ekspresji kolagenu typu XVII w BM naskórka sugerowało, że podstawowa zmiana genetyczna była nieobecna lub niewystarczająco reprezentowana w populacjach komórkowych badanych w tych badaniach. LCM ujawniło, że naskórek probanda był mozaiką dla mutacji przywracającej ramę 4080insGG. Aby zwiększyć możliwość wykrywania zmiany genetycznej wyrażonej w mozaikowy wzór, LCM zastosowano w celu pozyskania komórek naskórka probandu bezpośrednio pokrywających segmenty BM, które zawierały lub nie zawierały kolagenu typu XVII. DNA wyekstrahowano z tych 2 populacji komórek (w dalszej części określanych jako DNA pozytywny i negatywny pacjenta) i porównano z DNA wyekstrahowanym z normalnego naskórka z mikrododatkami laserowymi. Używając starterów specyficznych dla intronu, ekson 52 COL17A1 zamplifikowano PCR z tych próbek DNA i analizowano przez trawienie NlaIII. Badania te wykazały, że zarówno DNA pozytywny, jak i negatywny pacjenta pochodzą wyłącznie z alleli zawierających 4003delTC, a DNA z kontrolnej epidermy pochodzi z prawidłowych alleli COL17A1 (ryc. 2a). Jak pokazano na rycinie 2b, wyniki te zostały potwierdzone przez specyficzny dla allelu PCR. Co ciekawe, produkty PCR otrzymane przy użyciu starterów do amplifikacji 4003delTC w DNA pozytywnego pacjenta wykazały dublet, gdy analizowano na 4. 20% żelach poliakrylamidowych (Figura 2b), co sugeruje heterozygotyczność dla mutacji poniżej 4003delTC. Figura 2 Normalny allel COL17A1 nie był obecny w probandzie. (a) LCM użyto do zebrania komórek naskórka pokrywających segmenty probandowego naskórkowego BM, które wybarwiały pozytywny (+) lub negatywny (a) kolagen typu XVII za pomocą mikroskopii IF (IF); naskórek zebrany z normalnej ludzkiej skóry przez LCM służył jako kontrola (C). Genomowy DNA wyizolowano z tych próbek, a ekson 52 z COL17A1 zamplifikowano PCR i analizowano przez trawienie endonukleazą restrykcyjną. Dla ilustracji, schemat przedstawia ekson 52 (prostokąt) i jego flankujące regiony intronowe (linie ciągłe), które zostały zamplifikowane za pomocą PCR (startery oznaczone strzałkami). Pionowe przerywane linie oznaczają miejsca restrykcyjne endonukleazy NlaIII w produktach PCR otrzymanych z normalnego allelu COL17A1; rozmiary wynikowych fragmentów (w parach podstawowych) są wymienione w górnej części schematu. Strzałka skierowana do spodu eksonu 52 pokazuje miejsce cięcia NlaIII wprowadzone przez 4003delTC; to dodatkowe miejsce restrykcyjne NlaIII rozcina fragment o wielkości 185 pz na odcinki o wartości 151 i 32 pz, jak wskazano. Produkty PCR przedstawione powyżej i standard drabiny 100 pz (Std) poddano elektroforezie w 3% żelu agarozowym, a następnie wybarwiono bromkiem etydyny. Niestrawione produkty PCR pochodzące z DNA kontrolnego, jak również DNA negatywnych pacjentów i pozytywnych pacjentów, wszystkie wędrowały, jak pokazano. Analiza restrykcyjna NlaIII tych produktów PCR wykazała, że kontrolny DNA pochodził z normalnych alleli COL17A1 i że zarówno DNA pacjenta z wynikiem ujemnym, jak i DNA pacjenta pozytywnego pochodziło z alleli niosących 4003delTC. Zauważ, że fragmenty o długości 32 i 40 pz nie są widoczne w tym żelu. (b) To, że DNA pozytywnego pacjenta nie pochodziło z prawidłowych alleli COL17A1 zostało potwierdzone przez specyficzny dla allelu PCR przy użyciu starterów kończących się sekwencjami specyficznymi dla normalnych (ND, bez delecji) lub zmutowanych (D, delecja) alleli przy nukleotydzie 4003
[podobne: choroba bechterewa, ból żuchwy, bolące pięty ]