dr hilt łódź

Mutację zweryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Mutagenizowany 5. ramię usunięto z wektora pCR2.1-TOPO przez restrykcję EcoRI i sklonowano w miejscu EcoRI pKSloxPNTmod (39). The 3. ramię wektora zostało zamplifikowane z przednim primerem 5. -TTCTAGAAAGGTCAGCATATGTGGGGTGAGCGAGGGG-3. i primer odwrotny 5. -TCCACAAACCCTGGCATCTCCATTGGAGATGTGG-3. i klonowane do pCR2.1-TOPO XL. Następnie ramię usunięto z wektora i sklonowano w miejscach Notl i KpnI pKSloxPNTmod. Integralność kompletnego wektora zweryfikowano przez analizy restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA. Wektor linearyzowano KpnI i elektroporowano do komórek ES 129 / SvJae. Ukierunkowane klony zidentyfikowano metodą Southern blotting genomowego DNA strawionego EcoRI z 5. sonda flankująca. Sonda, o długości 348 bp, została zamplifikowana z genomowego DNA z przednim primerem 5 (3 -CAAGGAGCTCGGATTCTGTC-3. i primer odwrotny 5a-GTCAGGGAAGAGTGCAGAGG-3 .. Sonda wykryła prążek 10,4 kb w allelu Lmna typu dzikiego i prążek 9,7 kb z docelowego allelu. Ta sama sonda wykrywa pasmo 7,2 kb w allelu nokautowym Lmna (11). Przeprowadzono również genotypowanie metodą PCR w całym usuniętym segmencie DNA z przednim primerem 5 (3-AGGTGCCGGTCCTAAGAAGT-3. i primer odwrotny 5a-ACATGATGCTGCAGTTCTGG-3 .. Reakcja PCR dała fragment o długości 603 bp z allelu typu dzikiego i fragment 211 bp z docelowego allelu. Ukierunkowane komórki ES poddano mikroiniekcji do blastocyst, a chimeryczne potomstwo hodowano z samicami C57BL / 6 w celu wytworzenia heterozygot. Myszy heterozygotyczne (LmnaLCO / +) hodowano z myszami transgenicznymi (3-aktynę-Cre (40) w celu usunięcia floxed neo cassette. Genetycznie zmodyfikowane myszy. Zmpste24. /. myszy (14, 41) połączono z myszami LmnaLCO / + i analizowano potomstwo z krzyżówek Zmpste24 (3 / LmnaLCO / +. Ponadto myszy LmnaLCO / + łączono z Lmna + /. myszy do tworzenia myszy LmnaLCO / +. Genotypowanie Lmna przeprowadzono zarówno metodą Southern blotting (11), jak i metodą PCR. Genotypowanie Zmpste24 przeprowadzono za pomocą PCR z użyciem oligonukleotydów 5a-TCACATGGAGTGAATGCTCTG-3. i 5 (3 -AGTGAACACCAGGCCAGTTT-3; zmutowany produkt PCR miał 240 pz, a produkt typu dzikiego miał 320 pz. Wszystkie myszy miały mieszane tło genetyczne (> 90% C57BL / 6 i <10% 129 / SvJae). Myszy karmiono karmą dla zwierząt i umieszczano w wolnej od wirusów przeszkodzie z 12-godzinnym cyklem światło / ciemność. Myszy ważono co tydzień, a ich zdolność do zawisu do góry nogami z siatki oceniano jak opisano wcześniej (13, 14). Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez UCLA Institutional Animal Care and Use Committee. Mikroskopia komórkowa i immunofluorescencyjna. Pierwotne mysie zarodkowe fibroblasty zostały przygotowane z zarodków E13.5 (14). W eksperymentach immunocytochemicznych, fibroblasty dopasowane do liczby pasaży hodowano na szkiełkach nakrywkowych, utrwalano 3% paraformaldehydem i barwiono jak opisano wcześniej (15, 28, 35). Użyto pierwotnych przeciwciał: mysiego LAP2 monoklonalnego (rozcieńczenie 1: 400, BD Biosciences), mysiego emerin monoklonalnego (rozcieńczenie 1: 200; Novocastra Laboratories Ltd.), surowicy odpornościowej królika prelaminy A (rozcieńczenie 1: 5 000) i poliklonalnej królika poliklonalnego laminatu (Rozcieńczenie 1:50; Santa Cruz Biotechnology Inc.). Wtórnymi przeciwciałami były anty-królicze Cy3 (rozcieńczenie 1: 800, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) i anty-mysz Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1: 600, Invitrogen Corp.). DNA wykryto za pomocą DAPI (Sigma-Aldrich). Obrazy komórek uzyskano na mikroskopie Axiovert 40CFL (Zeiss) z obiektywem immersyjnym 63 x / 1,25 i przetworzono za pomocą oprogramowania AxoVision (wersja 4.2, Zeiss) lub na skaningowym mikroskopie konfokalnym z skanowaniem wiązką laserową TCS SP2 Acusto-Optical (Leica Microsystems) z obiektywem immersyjnym o mocy 63 × / 1,44. Liczbę komórek o normalnie ukształtowanych jądrach (gładki owalny kształt) i nienormalnie ukształtowanych jąder (pęcherzyków, rażąco nieregularny kształt lub wielokrotne fałdy) policzono 2 obserwatorów zaślepionych na genotyp [więcej w: gumtree bochnia, tomasz pągowski wikipedia, neorutin c ]