gastroskopia limanowa

Podobnie 30,9%. 4,8% komórek KIM1-PK1 zaobserwowano w fagocytozie apoptotycznych komórek LLC-PK1 w porównaniu z 4,4%. 1,0% komórek pcDNA-PK1. Wskaźnik fagocytarny również wzrósł, co określono na podstawie oceny mikroskopowej (komórki KIM1-PK1, 34,48 – 2,74 vs. komórki pcDNA-PK1, 4,88 – 1,13). Aby mieć pewność, że testy cytometrii przepływowej mierzyły fagocytozę, a nie tylko wiązały, internalizację badano w hodowlach inkubowanych w temperaturze 4 ° C, w temperaturze, która zapobiega internalizacji (17) i w temperaturze 37 ° C (Figura 5A). W 4 ° C, 0.07%. 0,11% komórek KIM1-PK1 miało zwiększoną fluorescencję, co wskazuje na fagocytozę, podczas gdy w 37 ° C, 11,34%. 4,51% komórek KIM1-PK1 wykazywało zwiększoną fluorescencję, co wskazuje na fagocytozę fluorescencyjnych komórek apoptotycznych (Figura 5A). Aby potwierdzić swoistość tych wyników, zastosowaliśmy układ komórek ekspresyjnych KIM-1 zależny od tetracykliny (tet-off) w komórkach nabłonka nerki psa nerkowokomórkowego MDCK (Supplemental Figure 1). Fagocytoza apoptotycznych komórek nabłonkowych była zależna od warunkowej ekspresji KIM-1 w komórkach MDCK (indukowane, 11,60%. 2,75% komórek przyjmowanych komórek apoptotycznych vs. nie indukowanych, 2,04%. 0,23%; Figura 4D). Fagocytoza, ale nie wiążąca komórek apoptotycznych przez komórki KIM1-PK1 była hamowana przez wstępne traktowanie cytochalasiną D i nokodazolem, inhibitorami polimeryzacji filamentów aktynowych i formowaniem mikrotubuli, odpowiednio (Figura 5B). Te wyniki w stabilnie transfekowanych liniach komórkowych nabłonka nerki potwierdziły rolę, jaką zidentyfikowaliśmy dla KIM-1 in vivo (Figura 1) oraz w pierwotnych hodowlach komórek nabłonkowych (Figura 2). Figura 4 Ilościowa analiza komórek apoptotycznych za pośrednictwem KIM-1. i fagocytozy materiału martwiczego. Wykresy cytometrii przepływowej zielonej fluorescencji względem rozproszenia bocznego (SSC) dla komórek nabłonka KIM1-PK1 i pcDNA-PK1, które spożyły znakowane fluorescencyjnie (CMFDA) apoptotyczne tymocyty (A), apoptotyczne komórki LLC-PK1 (B) lub nekrotyczne gruzy (nekrotyczne Komórki LLC-PK1) (C) w teście fagocytozy. Procenty reprezentują odsetek komórek nabłonka, które spożyły materiał znakowany fluorescencyjnie. Komórki KIM1-PK1, które nie spożyły komórek apoptotycznych lub szczątków, zostały użyte do zdefiniowania bramkowanego obszaru. Bez kokultury z komórkami nekrotycznymi tylko 0,93% komórek nabłonka eksprymujących KIM-1 (3 zidentyfikowano na bramkowanym obszarze. (D) Przepływowe cytometryczne wykresy zielonej fluorescencji względem rozrzutu bocznego dla komórek nabłonka MDCK z KIM1. Tet-off, które przyjęły fluorescencyjnie znakowane (CMFDA) apoptotyczne LLC-PK1 w teście fagocytozy. Komórki MDCK traktowano doksycykliną (100 ng / ml) w celu hamowania ekspresji KIM-1 (lewy panel) lub nie stosowano doksycykliny (5 dni), umożliwiając ekspresję KIM-1 na wysokim poziomie (prawy panel). Wartości reprezentują odsetek komórek nabłonka, które spożyły fluorescencyjnie znakowane komórki apoptotyczne. Komórki MDCK KIM1a-tet-off, które nie spożyły komórek apoptotycznych lub szczątków zostały użyte do określenia braku spożycia. Figura 5 KIM-1 pośredniczy w fagocytozie apoptotycznych komórek martwiczych, ale nie w innych celach fagocytozy, kulkach zymosanu lub lateksie. (A) Wykres przedstawiający procent komórek KIM1-PK1 lub pcDNA-PK1, które internalizowały fluorescencyjne apoptotyczne komórki LLC-PK1 po godzinie inkubacji z apoptotycznymi fluorescencyjnie znakowanymi komórkami w 37 ° C lub 4 ° C (na lodzie). W temperaturze 4 ° C następuje wiązanie, ale nie internalizacja. Komórki KIM1-PK1 wykazywały znacznie mniejszą fluorescencję w 4 ° C niż w 37 ° C (** P = 0,006, n = 3 na stan, słupki błędu wskazują SD). (B) Wykres przedstawiający fagocytozę (czarne słupki) przez komórki KIM1-PK1, co oceniono za pomocą cytometrii przepływowej (lewa oś, procentowe komórki fluorescencyjne) lub wiązanie plus fagocytozę (białe słupki), jak oceniono za pomocą spektrofotometrii (prawa oś, względna intensywność fluorescencji)
[podobne: validol cena, wakacje mikołajka chomikuj, wkładka wewnątrzmaciczna cena ]