grypa u dziecka ile dni gorączka

Zbadaliśmy również ekspresję kapsydu i otoczki w 4 z 5 próbek wątroby zakażonych HBV (rysunek 1c, środkowe panele). Nie stwierdzono wyraźnej korelacji między ekspresją HBSP a HBcAg lub HBsAg. Rzeczywiście, HBSP był silnie eksprymowany w próbkach z niewielkim lub brakiem kapsydu lub ekspresji otoczki (Figura 1c, środkowe panele, ścieżki 3. 5). Biologiczne efekty ekspresji ektopowej HBSP. Badaliśmy wpływ HBSP na replikację HBV w komórkach HuH7 przejściowo transfekowanych HBV lub kotransfekowanych wektorami wyrażającymi HBV i HBSP. Transkrypcję i replikację genomu HBV badano 40 godzin po transfekcji. W doświadczeniach kotransfekcji analiza Northern blot wykazała prążek 0,8 kb (Figura 2a, ścieżka 2), która odpowiada transkryptowi HBSP i nie hybrydyzuje z sondą specyficzną dla HBx (dane nie przedstawione). Tak więc nie zaobserwowano żadnej zmiany w poziomie wirusowego RNA o długości 3,5 kb i 2,1 kb po ekspresji HBSP (figura 2a, ścieżki i 2). Ponadto, w testach reporterowych lucyferazy, HBSP nie modyfikuje aktywności promotora kapsydu regulującego produkcję pregenomowego wirusa HBV (Figura 3). Przy użyciu tego samego testu ekspresja HBSP nie modyfikuje aktywności promotora genu HBx (Figura 3). Analiza Southern blot nie wykazała żadnych modyfikacji replikatywnych produktów wirusowego DNA (Figura 2a, ścieżki 3 i 4). Tak więc wymuszona ekspresja HBSP nie miała wykrywalnego wpływu, in vitro, na transkrypcję i replikację genomu HBV. Figura 2 (a) Brak wpływu in vitro ekspresji HBSP na transkrypcję i replikację HBV. Komórki HuH7 przejściowo transfekowano HBV (ścieżki i 3) lub kotransfekowano wektorami eksprymującymi HBV i HBSP (ścieżki 2 i 4). Czterdzieści godzin po transfekcji, transkrypty HBV (po lewej) i pośrednie replikacyjne DNA (po prawej) analizowano, odpowiednio, stosując analizę Northern lub Southern. RC, rozluźnienie okrągłego DNA; DL, dwuniciowy liniowy DNA; SS, DNA o pojedynczej nici. (b) Lokalizacja i ekspresja HBSP in vitro przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-HBSP. Top: Komórkowa dystrybucja HBSP w komórkach transfekowanych HuH7, ujawniona przez immunofluorescencję. Spód: analiza Western blot komórek HuH7 przejściowo eksprymujących HBSP (ścieżka 4) i nietransfekowanych komórek (linia 3). Masa cząsteczkowa (linia 2). Pozytywną kontrolą było białko bakteryjne pET-HBSP (linia 1). Figura 3 Wpływ białka HBSP na promotory kapsydu i HBx przy użyciu testu lucyferazy. Komórki HuH7 kotransfekowano albo genem lucyferazy pod kontrolą promotorów kapsydu albo HBx i pNeo (pCluc + pNeo; pXluc + pNeo), albo z wektorem eksprymującym HBSP i pCluc (pCluc + pHBSP) lub pXluc (pXluc + pHBSP). Wartości aktywności lucyferazy znormalizowano przez aktywność p-galaktozydazy w celu określenia wydajności transfekcji. Badano również komórkową lokalizację białka HBSP w komórkach HuH7 przejściowo transfekowanych wektorem wyrażającym HBSP. W transfekowanych komórkach za pomocą króliczych przeciwciał poliklonalnych anty-HBSP obserwowano dyfuzyjne barwienie jądrowe i cytoplazmatyczne immunofluorescencję (Figura 2b). Swoistość tych przeciwciał wykazano przy użyciu analizy Western blot komórek transfekowanych HuH7 (Figura 2b). Wpływ HBSP na wzrost komórek badano za pomocą testu żywotności komórek na komórkach CCL13 transfekowanych wektorami GFP-HBSP lub GFP. Najpierw sprawdziliśmy, czy zarówno GFP-HBSP, jak i HBSP mają tę samą komórkową lokalizację (dane nie są pokazane). Nie zaobserwowano wyraźnego wpływu ekspresji HBSP na żywotność komórek 36 godzin po transfekcji (Figura 4a, panele i 2). W przeciwieństwie do tego, 96 godzin po transfekcji zaobserwowano istotny spadek liczby komórek wyrażających GFP-HBSP w porównaniu z komórkami wyrażającymi GFP (Figura 4a, panele 3 i 4).
[hasła pokrewne: tasiemiec bąblowiec, eskulap pabianice, medix wieruszów ]