guz neuroendokrynny żołądka

Analiza tych produktów PCR na 4. 20% żelach poliakrylamidowych potwierdziła prawidłową sekwencję w kontrolnym DNA i wykazała, że zarówno DNA pacjenta z wynikiem ujemnym, jak i DNA pacjenta pozytywnego były amplifikowane z alleli zawierających 4003delTC. Obecność dubletu w DNA pozytywnego pacjenta (ale nie pacjenta negatywnego) przy użyciu starterów D sugeruje heterozygotyczność dla mutacji poniżej 4003delTC. Aby odsłonić drugą mutację, sekwencję eksonu 52 w mikrosadzeniowym DNA o pozytywnym ciele z laserem porównano z sekwencją DNA z mikroskopijnego mikroskopu laserowego normalnego ludzkiego naskórka (Figura 3a). Drugą mutację, 4080insGG, wykryto na allelu COL17A1 DNA pozytywnego pacjenta (Figura 3a). Klonowanie i sekwencjonowanie wykazały albo sam czas 4003delTC albo 4003delTC w połączeniu z 4080insGG (Figura 3b). Aby zweryfikować tę mutację, zaprojektowano startery do amplifikacji 4080inGG lub sekwencji bez insercji (I = insercja, NI = bez insercji, Figura 4). Prawidłowe DNA naskórka i DNA pacjenta z wynikiem ujemnym amplifikowano tylko za pomocą startera NI, co wskazuje na brak 4080inGG. Dodatni DNA pacjenta amplifikowano za pomocą starterów I i NI, jak oczekiwano dla próbki heterozygotycznej pod względem drugiej mutacji. Gdy te pary starterów zostały użyte do reekstrakcji DNA z wcześniejszych próbek hodowanych przez pacjenta keratynocytów i krwi obwodowej (tj. Próbek testowanych wcześniej na obecność prawidłowego lub skorygowanego allelu COL17A1), nie znaleziono 4080insGG. Te odkrycia, jak również całkowity brak kolagenu typu XVII w większości biopsji skóry, sugerują, że mniejszość tkanek probanda była mozaiką. Figura 3DNA z naskórka probandu pokrywającego kolagen zawierający BMII typu XVII jest homozygotyczna pod względem 4003delTC i heterozygotyczna pod względem drugiej mutacji COL17A1, 4080insGG. (a) Bezpośrednie sekwencjonowanie nukleotydowe egzonu 52 amplifikowanego PCR z prawidłowego naskórka (u góry) pokazuje oczekiwaną sekwencję. Naskórek pacjenta pokrywający się z wybarwieniem BM dodatnim dla kolagenu typu XVII wykazuje niejednoznaczności zasad rozpoczynające się od nukleotydu 4080 w cDNA (dół). (b) Klony produktu PCR w pokazie albo 4003delTC, a następnie oczekiwana sekwencja (tj. bez insercji, góra) lub 4003delTC w połączeniu z 4080insGG (na dole). Rysunek 4 Weryfikacja 4080insGG. PCR przy użyciu starterów, które amplifikowały 4080inGG (I, insercja) lub allel bez insercji (NI) wykazało obecność tego pierwszego tylko w DNA z naskórka pacjenta pokrywającego się z kolagenem zawierającym BMII typu XVII. Symbole są takie, jak zaznaczono na Figurze 2. Przywracająca strukturę mutacji 4080insGG daje mRNA COL17A1 i białko. Wyniki opisane powyżej wskazywały, że rekonstancyjne komórki naskórka probanda miały 2 zmutowane allele COL17A1, jeden zawierający 4003delTC sam i jeden zawierający 4003delTC plus 4080insGG. Odpowiednie poziomy transkryptów pochodzących z takich pojedynczych zmutowanych i podwójnie zmutowanych alleli COL17A1 w komórkach epidermy in vivo badano w serii eksperymentów. Nasze hipotezy były następujące: (a) transkrypty pochodzące od pojedynczych zmutowanych alleli byłyby obecne w niskich poziomach z powodu rozpadu mRNA z udziałem nonsensu (jak pokazano w poprzednich badaniach Northern blot badających całkowity RNA z hodowanych keratynocytów pacjentów homozygotycznych pod względem 4003delTC; ); i (b) transkrypty pochodzące od podwójnie zmutowanych alleli przewyższają te pochodzące z pojedynczych zmutowanych alleli z powodu eliminacji PTC przez mutację korygującą. w pierwszym. Aby określić względny poziom transkryptów pochodzących z pojedynczego allelu 4003delTC, LCM zastosowano do odzyskania naskórka z siostry probandu, o której wiadomo, że jest heterozygotyczna pod względem tej mutacji (18). Całkowity RNA został następnie wyizolowany, poddany odwrotnej transkrypcji, amplifikowany metodą PCR przy użyciu starterów specyficznych dla sekwencji, które zawierały lub nie zawierały 4003delTC, i oznaczany ilościowo za pomocą densytometrii
[hasła pokrewne: duofilm cena, tasiemiec bąblowiec, neorutin c ]