kiedy wychodza pierwsze zabki u dzieci

Uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienia nerki szczura przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (47). W skrócie, znieczulone szczury SD utrzymywano w 36,5-37,5 ° C. Nerki zostały odsłonięte poprzez nacięcia boczne i poddane obustronnemu zaciskaniu tętnic nerkowych za pomocą zacisków mikronaczyniowych i zwrócone do przestrzeni zaotrzewnowej. Po 30 minutach zaciski zostały usunięte, a nerki potwierdzone do reperfuzji. Rany zostały zamknięte. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Centrum Zasobów Zwierząt i Medycyny Porównawczej, Harvard Medical School. Materiały. Linie komórkowe LLC-PK1 i COS-7 pochodziły z ATCC, a FBS, DMEM i DMEM / F-12 pochodziły z Cellgro. Generowanie przeciwciał anty-Kim-1 AWE2.1, ABE3, ACA i R9 opisano wcześniej (9, 48), a wtórne przeciwciała pochodziły z DakoCytomation lub Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Znakowane i nieznakowane natywne LDL i ox-LDL pochodziły z Intracel Corp. i CMFDA pochodziły z firmy Invitrogen. Ludzki TNF-. pochodziło od Peprotech Inc. Inne odczynniki pochodziły od Sigma-Aldrich. Hodowlę komórkową. Pierwotne hodowle komórek proksymalnych kanalików nerki wytworzono przy użyciu ustalonych metod z modyfikacjami (12). W skrócie, kora nerkowa została wycięta z rdzenia, pokrojona w kostkę, a następnie strawiona w roztworze kolagenazy (0,5 mg / ml) (z inhibitorem trypsyny sojowej) przez 30 minut w temperaturze 37 ° C w urządzeniu do łaźni wodnej. Reakcja enzymatyczna została zakończona surowicą końską. Kłębuszki i pozostałe grudki tkanki rozdzielano przez dekantację po sedymentacji grawitacyjnej (2 minuty). Po dwukrotnym przemyciu w PBS, kanaliki ponownie zawieszono w pożywce tubulowej (DMEM / F-12 z transferyną, insuliną, selenem, hydrokortyzonem i EGF) i podzielono na porcje do płytek do hodowli tkankowych powleczonych kolagenem, zawierających autoklawowane szklane szkiełka nakrywkowe. Co drugi dzień medium zastępowano świeżą pożywką. Komórki nabłonkowe użyto w testach między dniem 4 a dniem 5. Komórki KIM1-PK1 wytworzono przez transfekcję komórek LLC-PK1 za pomocą pełnej długości cDNA ludzkiego KIM-1 (48) subklonowanych do ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA3 (Invitrogen) w celu wytworzenia konstrukt ekspresyjny KIM-1. Ten konstrukt transfekowano stosując Lipofectamine (Invitrogen) i stabilne transfektanty wybrane do oporności na G418. Komórki kontrolne (pcDNA-PK1) wytworzono przy użyciu pustego wektora pcDNA3. Klony wyizolowano przez ograniczone rozcieńczenie i ekspresję białka KIM-1 potwierdzono zarówno metodą western blot, jak i immunofluorescencją, stosując mysie przeciwciała przeciwko ludzkiemu KIM-1 (AKG7, AWE2) lub anty-ludzkie przeciwciało poliklonalne królika KIM-1 (nr 1400). jako przeciwciała pierwotne (48). Dwie pary komórek wyrażających KIM-1 (3 i komórek kontrolnych użyto do testu fagocytozy. Komórki MDCKII z KIM1. Tet-off wytworzono przy użyciu zestawów do ekspresji genów BD Tet-Off (Clontech) i komórek tet-off MDCK (Clontech). Ludzki cDNA KIM-1 subklonowano do konstruktów pTRE-hygro w celu wytworzenia pTRE . KIM-1, a konstrukt transfekowano do komórek tet-off MDCK (Clontech). Transfekowane i wybrane klony komórek MDCK klonów KIM1. Hodowano w DMEM / F-12/10% FCS, 250. G / ml higromycyny i 100. G / ml G418. Komórki hodowano w 100 ng / ml doksycykliny, aby zapobiec transkrypcji KIM1 aż do indukcji indukowanej przez jej wycofanie. Komórki KIM-1A GFP wytworzono przez subklonowanie ludzkiego KIM1 ORF (pełnej długości) do pEGFP N1 (Clontech), generując konstrukt fuzyjny z EGFP na C-końcu. Konstrukt transfekowano do komórek COS7 i wyselekcjonowano komórki stabilnie wyrażające (patrz powyżej). E-KIM1-ekto generowano przez klonowanie peptydu sygnałowego do 5 aminokwasów najbliżej domeny transbłonowej i wszystkich domen transbłonowych i cytoplazmatycznych do wektora pcDNA3. Linię komórkową a KIM1-ekto-pK1 wytworzono w komórkach LLC-PK1, jak opisano powyżej
[przypisy: ból kolana po bieganiu, neorutin c, borówka amerykańska kalorie ]