Revertant mosaicism: częściowa korekcja mutacji linii zarodkowej w COL17A1 przez mutację przywracającą ramkę

Eksperymenty z podwójnie przebarwionymi IF w mikroskopii wykorzystywały HD18 (1:20), biotynylowane owcze anty-mysie IgG (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, Illinois, USA) (1: 100), Texas Red streptawidynę (Amersham Life Sciences Inc.) (1:50), króliczą surowicę odpornościową anty-kolagen typu IV (pierwotnie opracowaną i dostarczoną przez G. Martina, National Institute of Dental Research, Bethesda, Maryland, USA) (1:20) i sprzężoną z FITC świńską IgG przeciwko króliczym IgG (DAKO Corp., Carpinteria, California, USA) (1:20). LCM. Kriosekacje skóry stosowane w LCM były obsługiwane na 2 sposoby. W celu odzyskania DNA, kriosekacje inkubowano sekwencyjnie z HDI i skoniugowanym z FITC kozim F (ab.) 2 anty-mysim IgG, przemywano, nakładano szkiełkiem nakrywkowym, a następnie oglądano pod mikroskopem IF w celu identyfikacji miejsc BM nabłonka, które zabarwiły albo dodatnie lub ujemny dla kolagenu typu XVII. Nakładki zostały usunięte, a zmapowane skrawki skóry utrwalono w etanolu i zabarwiono hematoksyliną i eozyną. Czapkę powleczoną membraną termoplastyczną umieszczono na wierzchu tych segmentów skóry, które zbadano za pomocą mikroskopu świetlnego z laserem z diodą impulsową (Arcturus Engineering Inc., Mountain View, Kalifornia, USA). Pod bezpośrednią obserwacją, impulsy laserowe od 40 do 60 mW zostały zastosowane do obszarów naskórka leżących nad BM, o których wiadomo, że miały barwnik dodatni lub ujemny w przypadku kolagenu typu XVII. leczenie, które specyficznie wiąże komórki naskórkowe będące przedmiotem zainteresowania z kapeluszem (19, 20). Czapkę wyjęto z kriosekcji, a wszelkie niespecyficznie przylegające komórki usunięto z membrany taśmą. Nakrywkę umieszczono na standardowej probówce do mikrowirówki zawierającej bufor do ekstrakcji, odwrócono i następnie poddano analizie w celu analizy genomowego DNA (patrz poniżej). W celu odzyskania RNA przygotowano seryjne kriosekacje skóry i co trzecią sekcję odwzorowano za pomocą mikroskopii IF, jak opisano powyżej. Korygowane krioseksje natychmiast utrwalono w 70% etanolu, wybarwiono hematoksyliną i eozyną i poddano LCM w celu odzyskania naskórka pokrywającego BM, który zawierał lub nie zawierał kolagenu typu XVII. Naskórek mikrododatkowaty z 6. 8 skrawków skóry zebrano na tej samej nakładce i zastosowano do analizy naskórkowego RNA (patrz poniżej). Ekstrakcja DNA. Naskórek mikrododatkowaty z 1. 3 skrawków skóry zebrano na tej samej nakrywce i umieszczono na probówce do mikrowirówki zawierającej 20 ul 10 mM Tris-HCl, mM EDTA, 1% Tween-20 i 0,1 mg / ml proteinazy K (pH 8.0). Probówki odwrócono i inkubowano w 37 ° C przez noc; proteinazy K inaktywowano przez ogrzewanie do 99,9 ° C przez 10 minut. Podwielokrotności otrzymanej mieszaniny zastosowano w badaniach PCR. Izolacja RNA. Czapki zawierające mikrodrobiony naskórek umieszczono na probówkach mikroprobówek wolnych od RNazy zawierających 200. L roztworu denaturującego i 1,6. L-merkaptoetanolu, a następnie poddano obróbce w celu uzyskania całkowitego RNA (Micro RNA Isolation Kit; Stratagene, La Jolla, California, USA). RNA zawieszono w 9 pi wody potraktowanej pirylo węglanem dietylu i 3 pi inhibitora RNazy (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, New Jersey, USA), a następnie przechowywano w temperaturze <70 ° C. Weryfikacja 4003delTC. PCR zastosowano do amplifikacji egzonu 52 (nukleotydy 3872 4261) genu kolagenowego typu XVII (GenBank nr M91669) przy użyciu starterów opartych na flankujących regionach intronowych, jak opisano poprzednio (17). Otrzymany produkt 527-bp strawiono NlaIII w celu wykazania obecności lub braku mutacji 4003delTC (17). W celu wykrycia 4003delTC stosowano również PCR specyficzny dla allelu. Eksperymenty te wykorzystywały startery, które kończą się sekwencjami specyficznymi dla normalnych lub zmutowanych alleli przy nukleotydzie 4003. Sensowne primery dla normalnych i zmutowanych sekwencji 4003delTC były 5 (3-GCTCCTCCTCACACAGCTCATC-3. i odpowiednio 5-GCTCCTCCTCACACAGCTCATG-3 .. Warunki cykli dla PCR specyficznego dla allelu były takie same jak dla egzonu 52, z tym wyjątkiem, że temperatura hybrydyzacji wynosiła 65 ° C [patrz też: olx wieruszów, eskulap pabianice, validol cena ]

Revertant mosaicism: częściowa korekcja mutacji linii zarodkowej w COL17A1 przez mutację przywracającą ramkę

Ta niedawno opracowana technika (19, 20) pozwoliła na selektywną izolację komórek naskórka leżących nad regionami BM, które wybarwiały się pozytywnie na kolagen typu XVII i odgrywała kluczową rolę w identyfikacji zdarzenia genetycznego odpowiedzialnego za białko immunoreaktywne w skórze tego pacjenta. Pokazujemy, że ten pacjent, homozygotyczny pod względem delecji linii zarodkowej 4003delTC, był mozaiką dla unikalnej mutacji przywracającej ramkę (4080insGG) na allelu. Druga mutacja eliminowała dalszy PTC, przeciwdziałała rozpadowi mRNA, w którym pośredniczy nonsens, i powodowała mierzalne poziomy tego podwójnie zmutowanego transkryptu. Chociaż ta częściowa korekta doprowadziła do wytworzenia białka o odpowiedniej immunoreaktywności i wielkości, wywnioskowano, że zawiera ona 25 nieprawidłowych aminokwasów kodowanych przez przesuniętą ramkę odczytu pomiędzy delecją a insercją. Badania te objaśniają molekularne podstawy nowej formy reaktywnego mozaikowania u ludzi, mianowicie częściową korektę mozaiki delecji zarodkowej przez drugą mutację przywracającą ramę. (więcej…)

Revertant mosaicism: częściowa korekcja mutacji linii zarodkowej w COL17A1 przez mutację przywracającą ramkę

Uogólniona, atroficzna, łagodna bullida epidermoliza jest autosomalną recesywną podnaskórkową chorobą pęcherzykową, charakteryzującą się mutacjami zerowymi w COL17A1. W dużym pokoleniu, dotknięte chorobą osoby były homozygotyczne pod względem delecji o wielkości 2 pz w COL17A1, 4003delTC, co spowodowało dalszy kodon przedwczesnego zakończenia, zanikanie mRNA z udziałem nonsensu i zniesienie syntezy kolagenu typu XVII. Co ciekawe, z tych pacjentów, chociaż fenotypowo identyczny z chorym rodzeństwem, wykazywał ogniskową ekspresję kolagenu typu XVII w naskórkowej błonie podstawnej, w sposób sugerujący rewizyjny mozaikowatość. Gdy badania losowo otrzymanych naskórka, śluzówki jamy ustnej i komórek krwi obwodowej nie pozwoliły zidentyfikować genetycznych podstaw tego pozornego mozaikowatości, mikroskopijne subpopulacje potencjalnie reaktywnych komórek naskórka (tj. Leżących nad nim błon podstawnych zawierających kolagen typu XVII) selektywnie izolowano za pomocą laserowej mikrodysekcji przechwytywania . (więcej…)

Revertant mosaicism: częściowa korekcja mutacji linii zarodkowej w COL17A1 przez mutację przywracającą ramkę

Antysensownym starterem dla obydwu tych specyficznych dla allelu badań PCR był intronowy starter stosowany do amplifikacji egzonu 52, wydłużony o 4 pz (5a-CCACAAACAAGAAAGCCAGTCTGG-3a). RT-PCR. Aby określić, czy egzon 52 został pominięty w probandzie, porcje całkowitego RNA z jej hodowanych keratynocytów zmieszano z losowymi heksamerami i odwrotnie transkrybowano w celu wytworzenia cDNA. Otrzymane cDNA zmieszano ze starterami dla COL17A1 (konkretnie, nukleotydy 3853 <3880 i 4610. 4630, pozycja 18) i powielono za pomocą PCR (GeneAmp RNA PCR, Perkin-Elmer Corp.) stosując 35 cykli w 95 ° C przez 30 sekund, 56 ° C przez 30 sekund i 72 ° C przez 60 sekund. (więcej…)