Revertant mosaicism: częściowa korekcja mutacji linii zarodkowej w COL17A1 przez mutację przywracającą ramkę

Antysensownym starterem dla obydwu tych specyficznych dla allelu badań PCR był intronowy starter stosowany do amplifikacji egzonu 52, wydłużony o 4 pz (5a-CCACAAACAAGAAAGCCAGTCTGG-3a). RT-PCR. Aby określić, czy egzon 52 został pominięty w probandzie, porcje całkowitego RNA z jej hodowanych keratynocytów zmieszano z losowymi heksamerami i odwrotnie transkrybowano w celu wytworzenia cDNA. Otrzymane cDNA zmieszano ze starterami dla COL17A1 (konkretnie, nukleotydy 3853 <3880 i 4610. 4630, pozycja 18) i powielono za pomocą PCR (GeneAmp RNA PCR, Perkin-Elmer Corp.) stosując 35 cykli w 95 ° C przez 30 sekund, 56 ° C przez 30 sekund i 72 ° C przez 60 sekund. Sekwencjonowanie DNA. Produkty PCR sekwencjonowano (ABI Prism, Perkin-Elmer Corp.) bezpośrednio lub po klonowaniu przy użyciu zestawu do klonowania TOPO TA (Invitrogen, San Diego, Kalifornia, USA). Sekwencje o szczególnym znaczeniu analizowano za pomocą oprogramowania Sequencher 3.0 (Gene Codes Corp., Ann Arbor, Michigan, USA). W badaniach tych zidentyfikowano 4080inGG, insercję o wielkości 2 pz, która częściowo korygowała allel COL17A1 w rekonstancyjnych komórkach naskórka probandu (patrz Wyniki). Weryfikacja 4080insGG. Do potwierdzenia 4080insGG użyto PCR specyficznej dla allelu. Startery stosowane do amplifikacji 4080inGG lub normalnej sekwencji w tym miejscu to 5. -CCTGGGTGCAGGCGGGGGT-3. i odpowiednio 5-CCTGGGTGCAGGCGGTGC-3a; temperatura wygrzewania dla tej reakcji wynosiła 57 ° C. Antysensowny starter był ponownie intronowym starterem stosowanym do amplifikacji egzonu 52, przedłużonym o 4 pz. Analiza transkryptów COL17A1. Po identyfikacji mutacji przywracającej ramkę, 4080insGG, zaprojektowano eksperymenty do oceny względnych poziomów transkryptów COL17A1 pochodzących z każdego allelu w rekonstancyjnych komórkach naskórka probandu, tj. Komórek zawierających allel 4003delTC i allel, które niosły oba 4003delTC i 4080insGG. Dla celów porównawczych w analogicznych eksperymentach oceniano względne poziomy transkryptów COL17A1 pochodzących z każdego allelu w heterozygoty, tj. Nienaruszonego rodzeństwa z allelem normalnym i 4003delTC. W ten sposób zbadano względną stabilność pojedynczych mutantów (4003delTC) i podwójnych mutantów (4003delTC i 4080insGG) transkryptów COL17A1 i zbadano zdolność podwójnie zmutowanego allelu do ratowania transkryptów COL17A1 z rozpadu mRNA, w którym pośredniczy nonsens. W celu rozwiązania tego problemu zastosowano dwa podejścia. W jednym zestawie eksperymentów użyto LCM do zbierania komórek naskórka odwracających proband, jak również komórek naskórka rodzeństwa, o którym wiadomo, że jest heterozygotą pod względem 4003delTC. Transkrypty w tych próbkach poddano odwrotnej transkrypcji i cDNA COL17A1 zamplifikowano za pomocą PCR specyficznego dla allelu, stosując sensowne startery dla normalnych i zmutowanych sekwencji (jak opisano powyżej) w połączeniu z antysensownym starterem odpowiadającym nukleotydom 4610. 4630 cDNA. Otrzymane produkty PCR poddano elektroforezie na 4-20% żelach poliakrylamidowych (Novex, San Diego, Kalifornia, USA), wybarwiono bromkiem etydyny, sfotografowano i oceniono ilościowo za pomocą densytometrycznej analizy intensywności pasma przy użyciu programu NIH Image 1.60 domeny publicznej (opracowanego w NIH i dostępne pod adresem http://rsb.info.nih.gov/nih-image/). W innym zestawie eksperymentów, powtórne komórki naskórka w probandzie zostały wyizolowane za pomocą LCM i poddane obróbce w celu uzyskania RNA. RNA poddano odwrotnej transkrypcji jak opisano powyżej i zamplifikowano metodą PCR przy użyciu starterów obejmujących egzony 51. 56 COL17A1. Powstałe cDNA sklonowano i analizowano przez sekwencjonowanie (n = 6) lub PCR specyficzny dla allelu (n = 19) w celu oszacowania względnych poziomów transkryptów pochodzących z każdego allelu COL17A1. Badania immunoprecypitacji. Subkonfluentne monowarstwowe hodowle keratynocytów pochodzące z biopsji skóry lewego przedramienia i barku probanda (lub z normalnych noworodkowych napletków kontrolnych) były biosyntetycznie znakowane radioaktywnie [35S] metioniną (50 CiC / ml, aktywność właściwa ~ 1100 Ci / mmol; Du Pont NEN Research Products, Boston, Massachusetts, USA) przez 2 godziny
[przypisy: tasiemiec bąblowiec, zdrovita nowy tomysl, tomasz pągowski wikipedia ]

Revertant mosaicism: częściowa korekcja mutacji linii zarodkowej w COL17A1 przez mutację przywracającą ramkę

Eksperymenty z podwójnie przebarwionymi IF w mikroskopii wykorzystywały HD18 (1:20), biotynylowane owcze anty-mysie IgG (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, Illinois, USA) (1: 100), Texas Red streptawidynę (Amersham Life Sciences Inc.) (1:50), króliczą surowicę odpornościową anty-kolagen typu IV (pierwotnie opracowaną i dostarczoną przez G. Martina, National Institute of Dental Research, Bethesda, Maryland, USA) (1:20) i sprzężoną z FITC świńską IgG przeciwko króliczym IgG (DAKO Corp., Carpinteria, California, USA) (1:20). LCM. Kriosekacje skóry stosowane w LCM były obsługiwane na 2 sposoby. W celu odzyskania DNA, kriosekacje inkubowano sekwencyjnie z HDI i skoniugowanym z FITC kozim F (ab.) 2 anty-mysim IgG, przemywano, nakładano szkiełkiem nakrywkowym, a następnie oglądano pod mikroskopem IF w celu identyfikacji miejsc BM nabłonka, które zabarwiły albo dodatnie lub ujemny dla kolagenu typu XVII. (więcej…)

Revertant mosaicism: częściowa korekcja mutacji linii zarodkowej w COL17A1 przez mutację przywracającą ramkę

Ta niedawno opracowana technika (19, 20) pozwoliła na selektywną izolację komórek naskórka leżących nad regionami BM, które wybarwiały się pozytywnie na kolagen typu XVII i odgrywała kluczową rolę w identyfikacji zdarzenia genetycznego odpowiedzialnego za białko immunoreaktywne w skórze tego pacjenta. Pokazujemy, że ten pacjent, homozygotyczny pod względem delecji linii zarodkowej 4003delTC, był mozaiką dla unikalnej mutacji przywracającej ramkę (4080insGG) na allelu. Druga mutacja eliminowała dalszy PTC, przeciwdziałała rozpadowi mRNA, w którym pośredniczy nonsens, i powodowała mierzalne poziomy tego podwójnie zmutowanego transkryptu. Chociaż ta częściowa korekta doprowadziła do wytworzenia białka o odpowiedniej immunoreaktywności i wielkości, wywnioskowano, że zawiera ona 25 nieprawidłowych aminokwasów kodowanych przez przesuniętą ramkę odczytu pomiędzy delecją a insercją. Badania te objaśniają molekularne podstawy nowej formy reaktywnego mozaikowania u ludzi, mianowicie częściową korektę mozaiki delecji zarodkowej przez drugą mutację przywracającą ramę. (więcej…)

Revertant mosaicism: częściowa korekcja mutacji linii zarodkowej w COL17A1 przez mutację przywracającą ramkę

Uogólniona, atroficzna, łagodna bullida epidermoliza jest autosomalną recesywną podnaskórkową chorobą pęcherzykową, charakteryzującą się mutacjami zerowymi w COL17A1. W dużym pokoleniu, dotknięte chorobą osoby były homozygotyczne pod względem delecji o wielkości 2 pz w COL17A1, 4003delTC, co spowodowało dalszy kodon przedwczesnego zakończenia, zanikanie mRNA z udziałem nonsensu i zniesienie syntezy kolagenu typu XVII. Co ciekawe, z tych pacjentów, chociaż fenotypowo identyczny z chorym rodzeństwem, wykazywał ogniskową ekspresję kolagenu typu XVII w naskórkowej błonie podstawnej, w sposób sugerujący rewizyjny mozaikowatość. Gdy badania losowo otrzymanych naskórka, śluzówki jamy ustnej i komórek krwi obwodowej nie pozwoliły zidentyfikować genetycznych podstaw tego pozornego mozaikowatości, mikroskopijne subpopulacje potencjalnie reaktywnych komórek naskórka (tj. Leżących nad nim błon podstawnych zawierających kolagen typu XVII) selektywnie izolowano za pomocą laserowej mikrodysekcji przechwytywania . (więcej…)