sanatorium konstancin jeziorna biały dom

Pasek skali: 10 .m. Aby bardziej szczegółowo ocenić właściwości fagocytarne Kim-1, wyhodowaliśmy pierwotne komórki nabłonkowe kanalika proksymalnego z nerek myszy i szczurów, stosując ustalone metody (12). Pierwotne hodowle komórek kanalikowych szczura eksprymowały Kim-1 w około 25% komórek po 4 dniach w hodowli (Figura 2A). Kim-1 ulegał ekspresji w komórkach wyrażających cytokeratynę, potwierdzając ich tożsamość jako pierwotne komórki nabłonkowe kanalików (Figura 2B). Monowarstwy hodowano przez godzinę w 37 ° C z fluorescencyjnymi tymocytami znakowanymi dioctanem 5-chlorometylofluoresceiny (CMFDA), po czym nieestetyczne komórki apoptotyczne wypłukano (Figura 2, A i C). Pojedyncza warstwa nabłonka szczurów była kolabelkowana przeciwciałami przeciwko Kim-1. Występowało wyraźne wiązanie i fagocytoza komórek apoptotycznych w ekspresjonujących Kim-lp, ale nie sąsiadujących z pierwotnymi komórkami Kim-1 (3 ujemnymi. Obserwowaliśmy również Kim-1 zlokalizowane w fagocytarnym kubku i fagosomie (ryc. 2A). Określono komórki apoptotyczne związane z komórkami nabłonkowymi Kim-lp-pozytywnymi i Kim-l-ujemnymi (Figura 2C). W tym teście niektóre komórki apoptotyczne były związane z powierzchnią komórki, a inne były fagocytowane. W celu bezpośredniego określenia roli Kim-1 w procesie fagocytarnym, hodowlę z komórkami apoptotycznymi przeprowadzono w obecności monoklonalnych przeciwciał anty-Kim-1 z powinowactwem do ektodomeny lub przeciwciał kontrolnych izotypu (Figura 2D). Po koinkubacjach i przemyciu, adherentne komórki pierwotne przeniesiono do zawiesiny pojedynczych komórek z EDTA i trypsyną, a poszczególne zawieszone komórki nabłonkowe zliczono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przeciwciała Kim-1 znacząco hamowały fagocytozę w tym teście, wskazując, że sam Kim-1 odegrał bezpośrednią rolę w fagocytozie (figura 2D). Dalszej analizy w komórkach pierwotnych nie można było przeprowadzić, ponieważ pierwotnie hodowane komórki nabłonka nie przeżywają pasażowania in vitro i wykazują zmienne poziomy autofluorescencji. W celu zbadania roli KIM-1 w fagocytozie komórek nabłonka dalej, trwale eksprymowaliśmy pełnej długości ludzki KIM-1 w świńskich komórkach nabłonka kanalików nerkowo-nerkowych LLC-PK1 (komórki KIM1-PK1), które nie wyrażają natywnego białka ( Dodatkowa Figura 1A, materiał uzupełniający dostępny w Internecie za pomocą tego artykułu; doi: 10.1172 / JCI34487DS1), a także ustanowiła linie komórek nabłonka nerki MDCK II nerek, które można indukować ekspresji KIM-1 przez usuwanie doksycykliny (Suplementowa Figura 1B). Po kokulturze komórek KIM1-PK1 z apoptotycznymi tymocytami, które wyznakowano fluorescencyjną CMFDA, KIM-1 umiejscowiono początkowo w kubku fagocytarnym, gdzie komórki apoptotyczne przyłączono do powierzchni komórek nabłonka (Figura 3A, lewy panel). Później KIM-1 zlokalizowany do fagosomów, które zawierały komórki apoptotyczne (rysunek 3A, prawy panel). Gdy wykonano zdjęcia konfokalne komórek KIM1-PK1 znakowanych fallosyliną w celu pokazania cytoszkieletu aktynowego, było jasne, że komórki apoptotyczne były w fagosomach (Figura 3B). Dodatkowo, wytworzyliśmy pełnej długości białko CIM-1. GFP C-koniec. I ulegało stabilnej ekspresji tego białka w komórkach COS-7. Zdjęcia poklinowe komórek KIM-1A GFP przyjmujących apoptotyczne komórki wykazywały wczesną rekrutację KIM-1 do kielicha fagocytarnego, w którym zachodzi wstępne wiązanie komórek apoptotycznych, a następnie dalsze wzmacnianie fluorescencji KIM-1 w fagosomie po udanym wchłonięciu (Dodatkowa ilustracja 2 i dodatkowe wideo 1). Figura 2 Główne hodowane komórki nabłonkowe nerki wyrażają komórki apoptotyczne Kim-1 i fagocytozę za pomocą mechanizmu zależnego od Kim-1 .. (A) Po kokulturze z apoptotycznymi tymocytami, Kim-1 (dodatni (Kim-1 +) (czerwony z niebieskim jądrem [N]), ale nie Kim-1 (ujemny (Kim-1 (3) (tylko niebieskie jądra [n]) komórki nabłonka wykazują silne wiązanie (groty strzałek) i internalizację fluorescencyjnie znakowanych apoptotycznych tymocytów (zielonych i niebieskich) (strzałki)
[hasła pokrewne: gumtree bochnia, gumtree inowrocław, guz neuroendokrynny ]