trzustka wielkość

Pełnej długości SRA-II sklonowano z cDNA z makrofagów otrzewnowych myszy do pCR2.1, a następnie subklonowano do pcDNA3. Komórki LLC-PK1 transfekowano stosując Lipofektaminę za pomocą pcDNA3 . SRA-II lub pustego wektora, a ekspresję SRA potwierdzono immunofluorescencyjnie z użyciem przeciwciał anty-CD204 (Serotec). Immunolabelowanie. Skrawki parafiny ponownie uwodniono i znakowano króliczym anty-szczurzym przeciwciałem Kim-1 (R9), a następnie biotynylowane przeciwciało drugorzędowe z królika i znakowanie DAB peroksydazą DAB, jak opisano wcześniej (9). Mrożone skrawki utrwalone w PLP znakowano przeciwciałem R9, a następnie przeciwciałem drugorzędowym skoniugowanym z Cy3 (9). Jądra apoptotyczne wizualizowano stosując DAPI (Invitrogen) przy 12,5 .g / ml w Vectashield (Vector Laboratories). Identyfikację komórek TUNEL-dodatnich w tkankach utrwalonych w PFA opisano uprzednio (49) przy użyciu znakowanego FITC dUTP (Roche) w końcowej reakcji zależnej od transferoksazy deoksynukleotydylowej inkubowanej przez godzinę w 37 ° C, a następnie znakowania przeciwciałem R9 (9). . Makrofagi w tkankach nerki barwiono anty-szczurzym CD68 (Serotec), a następnie sprzężonym z Cy2 drugorzędowym przeciwciałem. Komórki KIM1-PK1 i komórki pcDNA-PK1 wysiano w ilości 3,0 x 105 na studzienkę w 4-dołkowej komorze suwakowej lub 1,5 x 105 na studzienkę w 8-dołkowej komorze suwakowej (Lab-Tek; Nunc). Przemyte komórki utrwalono 2% PFA i permeabilizowano 0,1% Triton X-100. Po zablokowaniu komórki inkubowano z mysim anty-ludzkim supernatantem KIM-1 (klon AWE 2.1) przez godzinę, a następnie anty-mysim Cy3 (rozcieńczenie 1: 800) przez 30 minut, a następnie przemyto i zamontowano jak opisano powyżej. Kapsle ekspresyjne KIM-1 (3 w zewnętrznym rdzeniu nerki 48 godzin po uszkodzeniu niedokrwiennym policzono w polach 40 × o dużej mocy (HPF) (n = 3). Proporcja zawierająca wewnątrzkomórkowe, poplamione DAPI fragmentowane ciała jądrowe o charakterystycznych cechach morfologicznych ciał apoptotycznych (50) została oceniona w 5 losowo wybranych polach. W tych samych HPF, kanaliki KIM-1 ujemne policzono i oceniono pod względem proporcji zawierających wewnątrzkomórkowe ciała apoptotyczne znakowane DAPI. Zdolne obrazy immunofluorescencji uzyskano za pomocą mikroskopu NIKON TE2000 z oprogramowaniem do dekonwolucji Auto DeBlur, jak opisano wcześniej (49). Komórki KIM1-PK1 hodowano razem z znakowanymi CMFDA apoptotycznymi tymocytami przez 2 godziny, niezwiązane komórki wymywano i monowarstwę utrwalano. Struktury komórkowe wizualizowano za pomocą barwienia falloidyną-rodaminą. Pierwotne hodowle szczurów szczurów inkubowano z króliczymi anty-szczurzymi przeciwciałami poliklonalnymi (R9) i mysimi przeciwciałami przeciw ludzkiemu cytokeratynie (klon C22), jak opisano wcześniej. Komórki KIM1-PK1 i komórki pcDNA-PK1 inkubowano z króliczymi przeciwciałami anty-ludzkimi CD36 (podarunek od Simone B. Brown, University of Edinburgh Medical School, Edynburg, Wielka Brytania) lub kozie przeciwciała anty-SRB1 (Abcam). Wykrywanie mRNA metodą PCR. Makrofagi myszy hodowano ze szpiku kostnego myszy, jak opisano wcześniej (51). Siedmiodniowe makrofagi stymulowano LPS (500 ng / ml) lub deksametazonem (500 nM) przez 24 godziny. RNA oczyszczono i wytworzono cDNA, jak opisano wcześniej (52). MRNA Kim-1, Emr-1 i Gapdh wykryto stosując następujące pary starterów: Kim1, 5a-ATGAATCAGATTCAAGTCTTC-3a, 5a-TCTGGTTTGTGAGTCCATGTG-3y; Emrl, 5a-TTTTCAGATCCTTGGCCATC-3a, 5a-ACACTGGGGCACTTTTGTTC-3; Gapdh, 5. ACTCCACTCGGCAAATTC-3a, 5a-CACATTGGGGGTAGGACCAC-3 .. PCR powtórzono 35 razy w następujących warunkach: 94 ° C przez 30 sekund, 50 ° C przez 30 sekund i 72 ° C przez 60 sekund. Transkrypty świńskie MFG-E8 i LOX-1 wykryto stosując pary starterów: Mfg-e8, 5a-ATCCCCAACAAGCAGATCAC-3a, 5a-CACTCAGAGGCACTGTTGGA-3; Lox-1, 5a-CTGTGCCTGGGATTACTGGT-3a, 5a-TGTCCCTCCAGGATGTCTTC-3 .. Transkrypty MFG-E8 i LOX-1 oznaczano ilościowo za pomocą ilościowego RT-PCR z zastosowaniem systemu do wykrywania Real-time PCR iQ5 z zestawem CYBR Green Super Mix (Bio-Rad), jak opisano wcześniej (52). Analiza Western blot Komórki poddano lizie i przygotowano lizaty, jak opisano wcześniej (53). Błony inkubowano z mysimi przeciwciałami przeciw ludzkiemu KIM-1 (klon ABE-3) lub anty-szczurzym Kim-1 (R9), a następnie odpowiednio przeciw-mysim lub anty-króliczym IgG-HRP. Prążki wizualizowano za pomocą chemiluminescencji (Western Lightning, PerkinElmer). Anty przeciwciała aktyny (Santa Cruz) zostały użyte do załadowania kontroli na pozbawionych membran (53). Generowanie białek fuzyjnych KIM1-Fc. Rozpuszczalne białko fuzyjne KIM-1-Fc (KIM1-Fc) wytworzono przez stabilną transfekcję komórek CHO konstruktem ekspresyjnym zawierającym ektodomenę KIM-1 połączoną z ludzkim regionem IgG-Fc. KIM1-Fc wyizolowano z kondycjonowanej pożywki za pomocą chromatografii A. Sepharose białka, jak opisano wcześniej
[podobne: wakacje mikołajka chomikuj, duofilm cena, wkładka wewnątrzmaciczna cena ]